翻译：王帅编辑：顾乔
引言
近年来，重症医学领域对静脉注射维生素C的兴趣迅速增加。最早研究注射维生素C对感染性休克患者的影响表明，静脉注射维生素C可以减少器官功能障碍、血管加压药依赖性，甚至降低死亡率。在随后的短时间内，有多项研究对脓毒症患者进行了验证，但研究结果并不一致，导致结果不一致可能是由于研究设计的不同，特别是给药方案(时机、持续时间和剂量)和联合用药选择的不同。例如，研究人员对维生素C的使用进行了单独研究，或与硫胺素和/或氢化可的松联合使用，有时在对照组中氢化可的松的量不同。并且，脓毒症患者之间也有相当大的差异，因为脓毒症是一种异质综合征。因此，某些亚组患者可能比其他亚组患者从静脉注射维生素C治疗中获益更多。最近发表的一项关于死亡率的荟萃分析进行了亚组分析，发现维生素C对短期死亡率(30天)有好处。此外，3-4天的治疗时间可提高生存率，维生素C单独或联合治疗的结果无明显差异。一个特别令人感兴趣的群体是维生素C缺乏症患者。没有一项研究对维生素C缺乏患者进行亚组分析。这是可以理解的，因为血浆维生素C浓度的检测是比较困难的。
在这篇文章中，我们探讨了检测维生素C的实际问题和缺陷，并介绍一种新的潜在的替代标记物，用它可以评估维生素C的状态。
维生素C治疗的理论基础
维生素C在人体内具有多种功能，包括抗氧化、抗炎和免疫支持作用。它在去甲肾上腺素和血管加压素的生物合成中起辅助作用，增加儿茶酚胺的敏感性，保护微循环，促进伤口愈合。因此，低血浆浓度可能会对ICU人群产生不良影响。在脓毒症、创伤、出血、心脏骤停后和烧伤患者中血浆维生素C浓度会降低。在感染性休克患者中，维生素C减少症(23μμ/l)和维生素C缺乏症(11mol/l)的发生率分别高达88%和38%。维生素C缺乏的原因是摄入和吸收减少，最重要的是，由于过度的氧化应激，代谢消耗增加和循环减少。氧化应激的增加在全身炎症反应和缺血/再灌注损伤的病理生理学中起着关键作用。维生素C通过提供电子来保护脂质、蛋白质和DNA免受氧化损伤。当氧化应激量过大时，维生素C就容易被消耗掉，循环利用就会变得不足，就会出现缺乏症。结果导致身体对氧化应激的保护变得不足。
这为严重氧化应激伴维生素C缺乏患者补充维生素C提供了强有力的理论依据。现有文献已经阐述了发现维生素C缺乏患者的重要性，方法是检测基线血浆维生素C浓度，在补充对比对照组和治疗组之间组织和血浆维生素C浓度的明显差异。此外，测量到达组织的血浆维生素C浓度可以帮助估计最佳血浆浓度。维生素C对自由基的直接清除作用随着超生理浓度的升高而增强。因此，检测维生素C将提供对剂量-浓度-临床结果关系的更多信息。
血浆维生素C测定
血浆维生素C或抗坏血酸的测定需要相当多的检验和分析工作。
抽血
为了评估体内的维生素C状态，关键是要避免体外的代谢现象，即维生素C(二十二碳六烯酸)氧化成脱氢抗坏血酸(DHA)，然后DHA不可逆地水解成2，3-二酮古醛酸(图1)。因此，必须在抽血后迅速处理样本，以获得可靠的维生素C结果。多种环境因素都能提高维生素C氧化成DHA的速率，其中抗凝剂的种类和环境温度的影响最为显著。维生素C在最初的几个小时内在肝素中保持最稳定。乙二胺四乙酸(EDTA)和血清全血在室温下不稳定，在2h内分别损失15%和20%。在EDTA血浆中，室温下2小时大约损失50%的维生素C，而在冰中从4小时开始显著下降。EDTA铁和铜的螯合物在生理pH下仍然具有氧化还原活性，并且仍然可以促进抗坏血酸的氧化，特别是在室温下。因此，为了减少采血后维生素C的流失，样品应在整个处理和加工过程中迅速处理并保持低温。然而，在运输过程中使用冰水来降低温度是很难管理的。并且，尽管室温是运送样品的方便的后勤条件，但遵守时间限制，在不到1h的时间内处理样品，以保持样品在室温下的完整性，医院来说仍是一个不可忽视的挑战。
样品处理
用偏磷酸、三氯乙酸或高氯酸酸化样品，可显著提高血浆中维生素C和DHA的稳定性，同时还可使血浆蛋白沉淀(脱蛋白)。酸化通常是在通过离心除去红细胞团之后进行的，以确保剩余蛋白质的有效沉淀过程。也可以通过添加甲醇来实现脱蛋白和稳定，医院实验室中使用较少。此时可以加入金属螯合剂EDTA或二乙烯-三氨基五乙酸(DTPA)，以进一步防止维生素C的体外氧化。样品酸化后，应在低温下保存，最好在?80°C下保存。已证明维生素C和DHA在?80°C下至少有5年的稳定性。
关于临床样本中DHA的产生，文献中一直存在争议。生理上，血浆中DHA的含量小于维生素C总量(抗坏血酸+DHA)的2%。危重患者的DHA含量可能会更高，这是因为DHA循环减少的过度氧化应激，以及接受药理剂量维生素C治疗的患者。然而，一项研究表明，在临床样本中，DHA的含量很低，甚至可以忽略不计。只有含有溶血的样品才有相当数量的DHA，这是因为在样品预处理的酸化步骤中，血红蛋白中的铁在体外释放。体外研究表明，三氯乙酸或高氯酸酸化的血浆中只有Fe3+引起的DHA升高，而偏磷酸不能引起DHA的升高。
然而，血浆血红蛋白在所有酸性溶液中都催化维生素C的氧化。因此，应避免溶血。偏磷酸是最好的稳定剂，因为铁离子在酸性溶液中更容易从转铁蛋白中释放出来，在使用偏磷酸时不会加速维生素C氧化成DHA。一项研究显示，与对照组相比，甲基磷酸酸化的临床样本中总维生素C作为DHA的比例更高，这意味着在体内也可能产生DHA。在我们对危重病患者进行的药代动力学研究中，10名患者服用2g维生素C，10名患者静脉注射10g维生素C，每日两次或连续48小时以上。在整个人群中，基线总维生素C浓度的中位数为22.7四分位数范围(IQR14.7-39.5)μ/l，血浆DHA浓度的中位数为2.5[0.9-5.1]μmol/l，是总维生素C浓度的10%(95%可信区间6.1-14.0%)(未发表数据)。与持续给药方案相比，间断给药方案的患者在输注后1小时和2小时血药浓度达到峰值，而连续给药方案的血药浓度在24小时和48小时后达到峰值。在表1中，总维生素C(抗坏血酸+DHA)、DHA和DHA占总维生素C的百分比显示在这些峰值时刻。在接受静脉注射维生素C治疗的患者中，DHA的绝对量增加，但DHA占总维生素C的百分比仍与基线相当。因此，DHA含量超过2%可能是由于危重疾病导致的循环减少的氧化应激增加、超生理学血浆浓度和维生素C的体外氧化造成的。
分析
血浆样品中维生素C的定量测定有两种不同的方法：酶法和色谱法。
酶促维生素C测定法
市面上有几种基于维生素C酶促转化的试剂盒，可以用分光光度法检测到。抗坏血酸氧化酶通常用在这类测定中。这些检测的常用方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)，它非常适合于样品的批量处理。便于立即测定少数样品中的值。
已经有几次尝试将这些基于酶的检测方法应用于自动配对的分析仪，但基于欧洲外部质量评估计划(InstandEQAS)中报告的方法，基医院内常规使用。如果临床上对立即测定维生素C的需求增加，这些基于酶的检测方法可以用于临床点或集中式平台，因为它们具有直接的技术性质。
色谱维生素C测定法
抗坏血酸和DHA的定量测定目前是通过高效液相色谱(HPLC)方法进行的。如果需要分析多个具有相似性质的化合物，或者如果有许多物质可能干扰感兴趣的化合物的定量，则高效液相色谱法是较好的方法。
将酸化样品注入HPLC仪器后，通过根据化合物的物理性质区分保留化合物的色谱柱进行分离。因此，在分离柱末端，抗坏血酸和DHA可以在不受其他化合物干扰的情况下被选择性地检测出来。目前，有两种方法检测通过色谱柱后的抗坏血酸和DHA。第一，电化学检测，利用抗坏血酸和DHA的氧化还原特性；第二，紫外检测，基于这些化合物的紫外吸收。尽管这两种检测方法给出的结果是相同的，但紫外光检测法因其技术相对简单而在常规检测中得到更广泛的应用。其他检测技术也已被使用，如抗坏血酸和DHA在柱前化学修饰成荧光化合物后的荧光检测，但不太常见。由于比色法/荧光法缺乏特异性，可能会产生较高的DHA浓度。
抗坏血酸、DHA和总维生素C的色谱分析
要评估总维生素C的状况，必须同时测定抗坏血酸和DHA。虽然原则上这些化合物可以在一次HPLC运行中同时定量，但这种方法并不经常使用，因为传统上不需要单独定量DHA来评估患者的维生素C缺乏症。另一个原因是，从技术上讲，只测定抗坏血酸要比同时测定抗坏血酸和DHA容易得多。因此，医学实验室已经优化了他们的高效液相色谱检测方法，以最佳地检测抗坏血酸，而不是抗坏血酸和DHA的结合。解决这一问题的一个便捷方法是在HPLC分析之前将样品中的DHA转化为抗坏血酸。通过加入还原剂，如三(2-羧乙基)盐酸膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)，可以将生成的尚未水解成不可逆的2，3-二酮基古龙酸的DHA还原为抗坏血酸。甚至可以使用添加了DTT的预改性肝素化管来立即减少任何形成的DHA。通过这种方式，可以测量样品中的总维生素C浓度(抗坏血酸+DHA)。结果表明，与室温下的不稳定性相比，DHA在4°C下可稳定数小时，在?80°C下不酸化贮存至少一年，在?80°C下酸化贮存至少5年。因此，如果样品得到适当的处理和处理，应该可以用TCEP和DTT等试剂回收任何被氧化的抗坏血酸。
关于维生素C总量测定的临床应用，必须考虑反应时间。如果分析前的样品前处理仅限于离心和脱蛋白，这大约需要45分钟，而分析过程本身，包括计算和验证，将额外花费30分钟。因此，在优化的专用条件下，需要1小时以上的时间才能得到定量结果。
由于分析的复杂性，许多临床化学实验室将维生素C的分析外包给其他实验室，使得维生素C检测无法进行常规护理。如果他们自己提供这种诊断服务，就不太可能立即确定。此外，保证维生素C测定正确的样品前处理相当繁琐，医院检验，特别是在重症监护和急诊科。因此，就诊时的维生素C测量可能是有用的，但目前还没有这样的测量方法。一个潜在的Sur-Rogate标志物是静态氧化还原电位(SORP)，它可以在床边快速测量。
静态氧化还原电位
SORP是一种反映血液中氧化应激总量的标记物，由Redox-SYS诊断系统(AytuBioscienceEnglewood，CO，USA)测量。它由便携式RedoxSYS分析仪和一次性传感器条组成(图2)。该护理设备可快速测量生物样本(如全血、血浆、血清或尿液)中已知和未知氧化剂和还原剂总量之间的净平衡。SORP结果显示在在将大约30μl的样品施加到传感器后的4分钟内显示小显示屏。从采血到得到SORP检测结果的总时间不到20分钟。有关该测试的更详细的技术信息可在其他地方获得。测量SORP的优点之一是它不依赖于单一的氧化应激生物标志物，如脂质过氧化。它提供了样本中氧化应激总量的全貌。
在健康志愿者和危重病人中，SORP与血浆维生素C浓度呈显著负相关(图3)。在ICU期间，SORP升高，血浆维生素C浓度和血浆总抗氧化能力下降。
在接受维生素C治疗的患者中，SORP显著降低。此外，在先前的体外研究中，加入维生素C后SORP也降低。这种强烈的关系是意料之中的，因为维生素C是一种极好的还原剂。维生素C能够迅速清除自由基，而且可以回收利用。因此，氧化应激总量将对维生素C总量产生重大影响，反之亦然。这些结果表明SORP有可能用于估计血浆维生素C浓度和筛选低维生素C状态。我们诊断准确性研究的初步数据显示，SORP可以准确地估计出低水平的血浆维生素C浓度，而在较高的范围内，它的精确度就不那么高了。与测定维生素C的费力的样品处理和分析不同，在未酸化、未还原的血浆中，SORP可在20分钟内、离心后立即测定，甚至在?80°C储存多年后测定。在床边使用时，建议在抽血和离心后尽快进行SORP测定，以最大限度地减少维生素C的体外氧化。尽管操作时间短，SORP测定在重症监护和急救医学中仍是非常有用的。
结论
本章强调了在危重病人中测量血浆维生素C浓度的潜在临床相关性，以及与目前可用的测量相伴随的实际困难。多项临床研究已经研究了静脉注射维生素C对危重病患者的影响，但结果并不统一。一个可能的解释是研究设计和纳入患者的异质性。与非维生素C缺乏症患者相比，维生素C缺乏症患者可能从维生素C治疗中受益更多。快速测定血浆维生素C可以识别这一亚群，但维生素C的体外氧化准备导致了一些实际困难。因此，维生素C测量既麻烦又耗时，而且无法进行常规护理。正确的血液处理、处理和分析以估计血浆维生素C浓度是获得可靠结果的关键。建议使用肝素抗凝管，在低温下处理样品不超过1h，并用偏磷酸酸化和脱蛋白使样品稳定。氧化维生素C(DHA)可以用DTT等还原剂回收。SORP可以使用新鲜的未经处理的血浆样本在20分钟内估计床边的维生素C状态。由于这种测量更实用，特别是对于急诊医学，SORP可以作为维生素C的替代标志物，从而评估维生素C状态低下的患者亚组中维生素C治疗的有效性。
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